咱们一般讲的柱层析一般是纠正相柱层析【】，柱子的填料是硅胶。硅胶外表有许多-SiOH基团，因而关于大极性的化合物的吸附才能较强，柱层析洗脱时，硅胶对小极性的化合物吸附才能较弱，所以先被洗脱下来。关于一些极性超大的化合物，硅胶的吸附才能太强以至于用常用的溶剂无法洗脱下来，无法用正相柱层析进行纯化。
这种情况下就要考虑进行反相柱层析，反相柱层析最常用的填料是C18反相硅胶填料，这类反相硅胶是运用C18烷基硅烷将硅胶的 -SiOH基团封住，形成了许多C18键合微孔，关于小极性的化合物吸附能强，相对立大极性的化合物的吸附才能弱，因而和正相硅胶的洗脱次序相反，因而称为反相硅胶。
咱们在进行反相柱层析时，梯度洗脱开端以大比例极性水溶液开端， 因为 C18 反 相 硅 胶 填料 外表疏水性， 疏水官能团就会产生蜷缩，因而运用前需求用极性有机溶剂活化（疏水官能团得以舒展），再过渡到水溶剂（坚持其吸附活性）。活化平衡的过程必不可少，否则会显着影响别离功率。
实验室中咱们一般运用过柱机进行反相柱层析，可是假设没有过柱机，可以像正相相同手动柱层析吗？当然是可以的。差异便是C18填料有点贵，需求重复运用，别像一般硅胶相同过完直接丢掉了。下面小编共享一下 加利福尼亚大学圣塔芭芭拉分校的C18反相柱层析规范操作。
这两个化合物，含有羧基，酚羟基等大极性基团，一般正相柱层析很难别离。反相TLC监测发现分的很开，合适反相柱层析。柱层析操作的流程和正相柱层析迥然不同。详细细节回看往期文章【】。
一般情况下，湿法上样就可以了，最好用水相系统溶解样品进行上样，假如溶解度欠好，能参加少数的有机相促溶。上样后，参加展开剂梯度洗脱，参加溶剂时不要将上层的沙子冲散。需求留意的几点：因为反相柱的压力比一般的正相柱大许多，整个操作的流程要在通风橱中进行，而且加压时将通风橱拉低，安全榜首。梯度洗脱过程中，可通过正相TLC监测反响，假如爬不起来可以测验一下EA:AcOH=200:1系统。
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