本规范替代GB/T 23502-2009《食物中赭曲霉毒素A 的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法》、GB/T 25220-2010《粮油查验粮食中赭曲霉毒素A 的测定 高效液相色谱法和荧光光度法》、GB/T 5009.96-2003《谷物和大豆中赭曲霉毒素A 的测定》、SN/T 1746-2006《进出口大豆、油菜籽和食用植物油中赭曲霉毒素A 的检测验证的办法》、SN/T 1940-2007《进出口食物中赭曲霉毒素A 的测定办法》和SN 0211-1993《出口粮谷中棕曲霉毒素A 的检测验证的办法》。

  ——增加了第三法免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法和第四法酶联免疫吸附测定法；

  本规范榜首法适用于谷物、油料及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品、葡萄干、胡椒粒/粉中赭曲霉毒素A的测定，第二法适用于玉米、稻谷(糙米)、小麦、小麦粉、大豆、咖啡、葡萄酒中赭曲霉毒素A的测定，第三法适用于玉米、小麦等粮食产品、辣椒及其制品等、啤酒等酒类、酱油等产品、生咖啡、熟咖啡中赭曲霉毒素A 的测定，第四法适用于玉米、小麦、大麦、大米、大豆及其制品中赭曲霉毒素A 的测定，第五法适用于小麦、玉米、大豆中赭曲霉毒素A的测定。

  用提取液提取试样中的赭曲霉毒素A，经免疫亲和柱净化后，选用高效液相色谱结合荧光检测器测定赭曲霉毒素A 的含量，外标法定量。

  除非还有阐明，本办法所用试剂均为剖析纯，水为GB/T 6682规则的一级水。

  3.2.2 提取液Ⅱ：称取150.0g氯化钠、20.0g碳酸氢钠溶于约950mL水中，加水定容至1L。

  3.2.4 冲刷液：称取25.0g氯化钠、5.0g碳酸氢钠溶于约950mL水中，加水定容至1L。

  3.2.5 真菌毒素清洗缓冲液：称取25.0g氯化钠、5.0g碳酸氢钠溶于水中，参加0.1mL吐温20，用水稀释至1L。

  3.2.6 磷酸盐缓冲液：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶解于约990mL水中，用浓盐酸调理pH 至7.0，用水稀释至1L。

  3.2.7 碳酸氢钠溶液(10g/L)：称取1.0g碳酸氢钠，用水溶解并稀释到100mL。

  赭曲霉毒素A(C20H18ClNO6，CAS号：303-47-9)，纯度≥99%。或经国家认证并颁发规范物质证书的规范物质。

  3.4.1 赭曲霉毒素A规范储藏液：准确称取一定量的赭曲霉毒素A 规范品，用甲醇-乙腈(50+50)溶解，配成0.1mg/mL的规范储藏液，在-20℃保存，可运用3个月。

  3.4.2 赭曲霉毒素A规范作业液：依据运用需求，准确移取一定量的赭曲霉毒素A规范储藏液(3.4.1)，用活动相稀释，别离配成适当于1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的规范作业液，4℃保存，可运用7d。

  3.5.1赭曲霉毒素A免疫亲和柱：柱规范1mL或3mL，柱容量≥100ng，或等效柱。

  提取办法1：称取试样25.0g(准确到0.1g)，参加100 mL 提取液Ⅲ，高速均质3 min或振动30min，定量滤纸过滤，移取4mL滤液参加26mL磷酸盐缓冲液混合均匀，混匀后于8000r/min离心5min，上清作为滤液A 备用。

  提取办法2：称取试样25.0g(准确到0.1g)，参加100 mL 提取液Ⅰ，高速均质3 min或振动30min，定量滤纸过滤，移取10mL滤液参加40mL磷酸盐缓冲液稀释至50mL，混合均匀，经玻璃纤维滤纸过滤，滤液B搜集于洁净容器中，备用。

  准确称取试样5.0g(准确到0.1g)，参加1g氯化钠及25mL提取液Ⅰ，振动30min，于6000r/min离心10min，移取15mL上层提取液，参加30mL磷酸盐缓冲液混合均匀，经玻璃纤维滤纸过滤，滤液C搜集于洁净容器中，备用。

  准确称取试样50.0g(准确到0.1g)(大豆需求磨细且粒度≤2mm)于均质器装备的拌和杯中，参加5g氯化钠及100mL甲醇(适用于油菜籽)或100mL提取液Ⅰ，以均质器高速均质提取1min。定量滤纸过滤，移取10mL滤液并参加40mL水稀释，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液弄清，滤液D 搜集于洁净容器中，备用。

  取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类样品运用前先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气)或其他不含二氧化碳的酒类试样20.0g(准确到0.1g)，置于25mL容量瓶中，加提取液Ⅱ定容至刻度，混匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液弄清，滤液E搜集于洁净容器中，备用。

  称取25.0g(准确到0.1g)混匀的试样，加提取液Ⅰ定容至50mL，超声提取5min。定量滤纸过滤，移取10mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液弄清，滤液F搜集于洁净容器中，备用。

  称取破坏试样50.0g(准确到0.1g)于均质器装备的拌和杯中，参加100mL碳酸氢钠溶液，将拌和杯置于均质器上，以22000r/min高速均质提取1min。定量滤纸过滤，准确移取10mL滤液并参加40mL淋洗缓冲液稀释，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液弄清，滤液G搜集于洁净容器中，备用。

  称取破坏试样25.0g(准确到0.1g)于均质器装备的拌和杯中，参加100mL碳酸氢钠溶液，将拌和杯置于均质器上，以22000r/min高速均质提取1min。将提取物置离心杯中以4000r/min离心15min。移取20mL滤液并参加30mL淋洗缓冲液稀释，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液弄清，滤液H 搜集于洁净容器中，备用。

  将免疫亲和柱衔接于玻璃注射器下，准确移取提取办法1中悉数滤液A 或提取办法2中20mL滤液B，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相衔接，调理压力，使溶液以约1滴/s的流速经过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，顺次用10mL线mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s~2滴/s，弃去悉数流出液，抽干小柱。

  将免疫亲和柱衔接于玻璃注射器下，准确移取30mL滤液C，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相衔接，调理压力，使溶液以约1滴/s的流速经过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，顺次用10mL线mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s~2滴/s，弃去悉数流出液，抽干小柱。

  将免疫亲和柱衔接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液D，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相衔接，调理压力，使溶液以约1滴/s的流速经过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，顺次用10mL线mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s~2滴/s，弃去悉数流出液，抽干小柱。

  将免疫亲和柱衔接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液E，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相衔接，调理压力，使溶液以约1滴/s的流速经过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，顺次用10mL冲刷液(3.2.4)、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s~2滴/s，弃去悉数流出液，抽干小柱。

  将免疫亲和柱衔接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液F，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相衔接，调理压力，使溶液以约1滴/s的流速经过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，顺次用10mL线mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s~2滴/s，弃去悉数流出液，抽干小柱。

  将免疫亲和柱衔接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液G，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相衔接，调理压力，使溶液以约1滴/s的流速经过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，顺次用10mL淋洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s~2滴/s，弃去悉数流出液，抽干小柱。

  将免疫亲和柱衔接于玻璃注射器下，准确移取10mL滤液H，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相衔接，调理压力，使溶液以约1滴/s的流速经过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，顺次用10mL淋洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s~2滴/s，弃去悉数流出液，抽干小柱。

  准确参加1.5mL甲醇或免疫亲和柱厂家引荐的洗脱液进行洗脱，流速约为1滴/s，搜集悉数洗脱液于洁净的玻璃试管中，45℃下氮气吹干。用活动相溶解残渣并定容到500μL，供检测用。

  a)色谱柱：C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm，或等效柱；

  在5.4.1色谱条件下，将赭曲霉毒素A 规范作业溶液按浓度从低到高顺次注入高效液相色谱仪，待仪器条件安稳后，以方针物质的浓度为横坐标(x 轴)，方针物质的峰面积积为纵坐标(y 轴)，对各个数据点进行最小二乘线性拟合，规范作业曲线)核算：

  规范作业溶液和样液中待测物的呼应值均应在仪器线性呼应规模内，假如样品含量超越规范曲线规模，需稀释后再测定。

  不称取试样按5.1、5.2和5.3的过程做空白试验。应承认不含有搅扰待测组分的物质。

  ρ ——试样测定液中赭曲霉毒素A 的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

  核算成果时需扣除空白值，检测成果以两次测定值的管用平均值表明，核算成果保存两位有用数字。

  样品中赭曲霉毒素A 含量在重复性条件下取得的两次独立测验成果的肯定差值不答应超出算术平均值的15%。

  粮食和粮食制品、食用植物油、大豆、油菜籽、葡萄干、胡椒粒/粉的检出限和定量限别离为0.3μg/kg和1μg/kg。酒类的检出限和定量限别离为0.1μg/kg和0.3μg/kg。酱油、醋、酱及酱制品的检出限和定量限别离为0.5μg/kg和1.5μg/kg。

  用提取液提取试样中的赭曲霉毒素A，经离子交流固相萃取柱净化后，选用高效液相色谱仪结合荧光检测器测定赭曲霉毒素A 的含量，外标法定量。

  除非还有阐明，本办法所用试剂均为剖析纯，水为GB/T 6682规则的一级水。

  赭曲霉毒素A(C20H18ClNO6，CAS号：303-47-9)，纯度≥99%。或经国家认证并颁发规范物质证书的规范物质。

  10.4.1 赭曲霉毒素A 规范储藏液：准确称取一定量的赭曲霉毒素A 规范品，用甲醇溶解配制成100μg/mL 的规范储藏液，于-20℃避光保存。

  10.4.2 赭曲霉毒素A 规范作业液：准确移取一定量的赭曲霉毒素A 规范储藏液(10.4.1)，用甲醇溶解配制成1μg/mL的规范储藏液，于4℃避光保存。

  11.3 固相萃取柱：高分子聚合物基质阴离子交流固相萃取柱，柱规范3mL，柱床分量200mg，或等效柱。

  玉米、稻谷(糙米)、小麦、小麦粉、大豆及咖啡豆等用高速全能破坏机将样品破坏，过20目筛后混匀备用。

  称取试样10.0g(准确至0.01g)，参加50mL三氯甲烷和5mL0.1mol/L的磷酸水溶液，于涡旋振动器上振动提取3min~5min，提取液用定性滤纸过滤，取10mL基层滤液至100mL平底烧瓶中，于40℃水浴顶用旋转蒸腾仪旋转蒸腾至近干，用20mL石油醚溶解残渣后参加10mL提取液，再用涡旋振动器振动提取3min~5min，静置分层后取基层溶液，用滤纸过滤，取5mL 滤液进行固相萃取净化。

  称取试样10.0g(准确至0.01g)，参加50mL提取液，于涡旋振动器上振动提取3min~5min，用定性滤纸过滤，取10mL滤液至100mL平底烧瓶中，参加20mL石油醚，涡旋振动器振动提取3min~5min，静置分层后取基层溶液，用滤纸过滤，取5mL滤液进行固相萃取净化。

  称取试样2.5g(准确至0.01g)于50mL聚丙烯锥形试管(带盖)中，参加25mL甲醇-碳酸氢钠溶液于涡旋振动器振动提取3min~5min，4000r/min离心10min后上清液用滤纸过滤，取10mL滤液进行固相萃取净化。

  移取试样10.0g(准确至0.01g)于烧杯中，参加6mL提取液，混匀，再用氢氧化钾溶液调pH 至9.0~10.0进行固相萃取净化。

  别离用5mL甲醇、3mL提取液活化固相萃取柱，然后将12.2制备的样品提取液参加固相萃取柱，调理流速以1滴/s~2滴/s的速度经过柱子，别离顺次用3mL淋洗液、3mL水、3mL甲醇淋洗柱，抽干，用5mL洗脱液洗脱，搜集洗脱液于玻璃试管中，于45℃下氮气吹干，用1mL乙腈-2%乙酸水溶液溶解，过滤后备用。

  a)色谱柱：C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm，或等效柱；

  在12.4的色谱条件下，将赭曲霉毒素A 规范作业溶液按浓度从低到高顺次注入高效液相色谱仪；待仪器条件安稳后，以方针物质的浓度为横坐标(x 轴)，方针物质的峰面积为纵坐标(y 轴)，对各个数据点进行最小二乘线性拟合，规范作业曲线)核算：

  ρ ——待测验样液中赭曲霉毒素A 的含量，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

  核算成果(需扣除空白值)以重复性条件下取得的两次独立测定成果的算术平均值表明，成果保存两位有用数字。

  在重复性条件下取得的两次独立测定成果的肯定差值不答应超出算术平均值的15%。

  葡萄酒检出限为0.1μg/L，定量限为0.33μg/L；其他样品检出限为1.0μg/kg，定量限为3.3μg/kg。

  用提取液提取试样中的赭曲霉毒素A，经免疫亲和柱净化后，选用液相色谱-串联质谱测定赭曲霉毒素A 的含量，外标法定量。

  除非还有阐明，本办法所用试剂均为剖析纯，水为GB/T 6682规则的一级水。

  17.2.2 提取液Ⅱ：称取150.0g氯化钠、20.0g碳酸氢钠溶于约950mL水中，加水定容至1L。

  17.2.4 3%碳酸氢钠溶液：称取30.0g碳酸氢钠，加水定容至1L。

  17.2.5 苯基硅烷固相萃取柱淋洗液1：甲醇-3%碳酸氢钠溶液(25+75)。

  17.2.6 苯基硅烷固相萃取柱淋洗液2：称取10.0g碳酸氢钠，加水定容至1L。

  17.2.8 磷酸盐缓冲液(PBS)：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，用水溶解，调理pH 至7.0，加水定容至1L。

  赭曲霉毒素A(C20H18ClNO6，CAS号：303-47-9)，纯度≥99%。或经国家认证并颁发规范物质证书的规范物质。

  17.4.1 赭曲霉毒素A 规范储藏液：准确称取一定量的赭曲霉毒素A 规范品，用甲醇-乙腈(1+1)溶解后配成0.1mg/mL的规范储藏液，于-20℃避光保存，可运用3个月。

  17.4.2 赭曲霉毒素A 规范作业液：依据运用需求移取一定量的赭曲霉毒素A 规范储藏液(17.4.1)，用空白样品提取液稀释，别离配成适当于1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的基质规范作业溶液。基质规范作业溶液现用现配。

  17.5.1 赭曲霉毒素A 免疫亲和柱：柱规范1mL，柱容量≥100ng，或等效柱。

  17.5.2苯基硅烷固相萃取柱：柱床分量500mg，柱规范3mL，或等效柱。

  将样品充沛破坏混匀，称取试样25.0g，参加5g氯化钠，用提取液Ⅰ定容至100mL，混匀，高速均质提取2min。定性滤纸过滤，移取10mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液弄清，搜集滤液A 于洁净的容器中。

  将样品充沛破坏混匀，称取试样25.0g，参加5g氯化钠，用提取液Ⅰ定容至100mL，混匀，高速均质提取2min。定性滤纸过滤，移取10mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液弄清，搜集滤液B于洁净的容器中。

  取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类样品运用前先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气)或其他不含二氧化碳的酒类试样25.0g，加50mL提取液Ⅱ，混匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液弄清，搜集

  称取25.0g混匀试样，用提取液Ⅰ定容至50mL，超声提取5min。定性滤纸过滤，移取10mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液弄清，搜集滤液D于洁净的容器中。

  将样品充沛破坏混匀，称取试样25.0g，参加200mL提取液Ⅲ，均质提取5min。8000r/min离心5min，上清液先后经定性滤纸和玻璃纤维滤纸过滤。移取4mL滤液于100mL容量瓶中，加PBS缓冲液定容至刻度，混匀，得提取液E。

  将样品充沛破坏混匀，称取试样15.0g，参加150mL提取液Ⅲ，轻摇30min。玻璃纤维滤纸过滤，移取约50mL滤液，4℃下4500r/min离心15min。取10mL上清液，参加10mL3%碳酸氢钠溶液得提取液F。

  准确移取10mL滤液A，注入玻璃注射器中，使溶液以约1滴/s的流速经过免疫亲和柱，顺次用10mLPBS缓冲液、10mL水淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s~2滴/s，弃去悉数流出液，抽干小柱。

  准确移取10mL滤液B，注入玻璃注射器中，使溶液以约1滴/s的流速经过免疫亲和柱，顺次用10mL PBS缓冲液、10mL水淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s~2滴/s，弃去悉数流出液，抽干小柱。

  准确移取10mL滤液C，注入玻璃注射器中，使溶液以约1滴/s的流速经过免疫亲和柱，顺次用10mL PBS缓冲液、10mL水淋洗免疫亲和柱，流速为1滴/s~2滴/s，弃去悉数流出液，抽干小柱。

  准确移取10mL滤液D，注入玻璃注射器中，使溶液以约1滴/s的流速经过免疫亲和柱，顺次用10m LPBS缓冲液、10mL水淋洗免疫亲和柱，流速为l滴/s~2滴/s，弃去悉数流出液，抽干小柱。

  分次将提取液E悉数注入玻璃注射器中，使溶液以2mL/min~3mL/min的流速悉数经过免疫亲和柱，坚持柱体湿润，用10mL水淋洗免疫亲和柱，流速≤3mL/min，弃去悉数流出液，吹干小柱30s。

  19.2.6.1 苯基硅烷固相萃取柱净化：预先顺次用15mL甲醇、5mL3%碳酸氢钠溶液活化苯基硅烷固相萃取柱，坚持柱体湿润。将提取液F 以≤5 mL/min的流速经过苯基硅烷固相萃取柱，再顺次用10mL 苯基硅烷固相萃取柱淋洗液1和5mL苯基硅烷固相萃取柱淋洗液2淋洗，吹干萃取柱后用10mL 苯基硅烷固相萃取柱洗脱液进行洗脱，得洗脱液G。

  19.2.6.2 免疫亲和柱净化：用30mLPBS缓冲液稀释洗脱液G，以≤5mL/min的流速经过免疫亲和柱，坚持柱体湿润，用10mL水淋洗后吹干小柱。

  以5mL甲醇分两次洗脱，流速为2mL/min~3mL/min，搜集悉数洗脱液于洁净的玻璃试管中，于40℃下氮气吹干，以1mL乙腈-水溶液(35∶65，体积比)复溶，微孔滤膜过滤后，玉米、小麦、辣椒及其制品等稀释1倍，啤酒等酒类浓缩5倍，酱油等产品等倍稀释后，供液相色谱-串联质谱测定。

  a)色谱柱：C18柱，柱长100mm，内径2.1mm，粒径3μm，或等效柱；

  活动相B液：95%乙腈水溶液(含有0.1%甲酸，5mmol/L甲酸铵)。

  d) 雾化气、气帘气、磕碰气、辅佐加热气均为高纯氮气，运用前应调理各气体流量以使质谱灵敏度到达检测要求；

  试样中赭曲霉毒素A色谱峰的保存时刻与相应规范色谱峰保存时刻相比较，改变规模应在±2.5%之内。每种化合物的质谱定性离子有必要呈现，至少应包含一个母离子和两个子离子，并且同一检测批次，对同一种化合物而言，样品中方针化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度适当的规范溶液比，其答应误差不超越表4规则的规模。

  方针化合物以保存时刻和两对离子(特征离子对/定量离子对)所对应的色谱峰面积相对丰度进行定性，一起要求测验样品中方针化合物的两对离子对应的色谱峰面积比与规范溶液中方针化合物的面积比共同。

  仪器最佳作业条件下，用系列基质规范作业溶液别离进样，以峰面积为纵坐标，以基质混合规范作业溶液浓度为横坐标，制作规范作业曲线。用规范作业曲线对样品进行定量，样品溶液中赭曲霉毒素A的呼应值均应在仪器测定的线 空白试验

  ρ ——试样测定液中赭曲霉毒素A 的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

  精密度在重复性测定条件下取得的两次独立测定成果的肯定差值不超越其算术平均值的15%。

  其他玉米、小麦等粮食产品、辣椒及其制品等检出限和定量限别离为1.0μg/kg和3.0μg/kg，啤酒等的检出限和定量限别离为1.0μg/kg和3.0μg/kg，熟咖啡、酱油等的检出限和定量限别离为0.5μg/kg和1.5μg/kg。

  原理用甲醇-水提取试样中的赭曲霉毒素A，提取液经过滤、稀释后，选用酶联免疫吸附法测定赭曲霉毒素A 的含量，外标法定量。

  试剂和资料除非还有阐明，本办法所用试剂均为剖析纯，水为GB/T6682规则的一级水。

  24.2.3 洗涤液：别离称取40.0g氯化钠、1.0g氯化钾、1.0g磷酸二氢钾、14.5g十二水磷酸氢二钠，参加2.5mL吐温20，用水溶解后定容至500mL，得到浓缩洗涤液，运用前用水10倍稀释。

  24.2.4 赭曲霉毒素A 稀释缓冲液：别离称取8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、0.2g磷酸二氢钾、2.9g十二水磷酸氢二钠，用水溶解后定容至1000mL。

  24.2.5 柠檬酸缓冲溶液：别离称取10.15g柠檬酸钠、13.76g柠檬酸，用水溶解后定容至1000mL。

  24.2.6 底物溶液甲：称取0.4gTMB用柠檬酸缓冲溶液溶解后定容至1000mL。

  赭曲霉毒素A(C20H18ClNO6，CAS号：303-47-9)，纯度≥99%。或经国家认证并颁发规范物质证书的规范物质。

  24.4.1 赭曲霉毒素A 规范储藏液：准确称取一定量的赭曲霉毒素A 规范品，用甲醇溶解后配成100μg/mL 的规范储藏液，在-20℃下避光保存，可运用3个月。

  24.4.2 赭曲霉毒素A系列规范作业液：依据运用需求移取一定量的赭曲霉毒素A规范储藏液(24.4.1)，用5%甲醇溶液稀释，别离配成适当于0ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL的规范作业液，在4℃下避光保存，可运用7d。

  24.5.1 抗抗体：能与赭曲霉毒素A 单克隆抗体特异性结合的抗体，例如羊抗鼠抗体或兔抗鼠抗体等。

  24.5.4 赭曲霉毒素A 酶标抗原：赭曲霉毒素A 与辣根过氧化物酶(HRP)偶联物。

  仪器和设备25.1 酶标测定仪：配有450nm 和630nm 的检测波长和振动功用。

  称取玉米、小麦、大麦、大米、大豆及其制品500.0g，用破坏机等破坏并经过1mm 试验筛，混匀后备用。

  称取试样5.0g(准确至0.1g)，参加25mL提取液，在多功用旋转混合器上振动提取10min或高速均质器均质提取3min或摇床振动40min。过滤提取液，移取200μL滤液置1.5mL离心管中，参加200μL 赭曲霉毒素A 稀释缓冲液后涡旋混匀，作为提取试样，备用。

  26.3.1 将赭曲霉毒素A 系列规范作业液和提取试样所用包被有抗抗体的微孔条刺进酶标板架，规范品和样品均需做平行试验，记载规范溶液和试样的方位。

  26.3.2 别离汲取50μL赭曲霉毒素A 系列规范作业液和提取试样加至相应的微孔中，然后各参加50μL 赭曲霉毒素A 酶标抗原，再参加50μL赭曲霉毒素A 抗体溶液，加盖，室温反响40min。

  26.3.3 弃掉孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上敲打以确保彻底除掉孔中的液体，然后每孔参加250μL 洗涤液，置振动器上振动后弃掉孔中液体，拍干。重复操作四次，洗板时每次距离20s，洗完后用力在吸水纸上排干。

  26.3.6 置酶标仪中，振动混匀，测定450nm 处的吸光度值，参比波长设为630nm。

  在仪器最佳作业条件下，测定赭曲霉毒素A 规范作业液的吸光度，以赭曲霉毒素A 规范品浓度值(ng/mL)的对数值为横坐标，百分吸光度值为纵坐标，制作规范作业曲线。用规范作业曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的吸光度值均应在仪器测定的线

  样品中赭曲霉毒素A 含量在重复性条件下取得的两次独立测验成果的肯定差值不答应超出算术平均值的15%。29

  玉米、小麦、大麦、大米、大豆及其制品的检出限和定量限别离为1μg/kg和2μg/kg。第五法

  用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇-水提取试样中的赭曲霉毒素A，提取液经液-液分配后，依据其在365nm 紫外光灯下产生黄绿色荧光，在薄层色谱板上与规范比较测定赭曲霉毒素A 的含量。31

  除非还有阐明，本办法所用试剂均为剖析纯，水为GB/T6682规则的一级水。31.1 试剂

  31.4.1 赭曲霉毒素A 规范储藏液：准确称取一定量的赭曲霉毒素A 规范品，用苯-冰乙酸(99+1)溶解后配成浓度为40μg/mL，用紫外分光光度计测定其浓度。浓度的测定参照GB5009.22中3.14条(赭曲霉毒素A 的最大吸收峰波长333nm，分子量403，克分子消光系数值为5550)。于-20℃避光保存，可运用3个月。

  一切玻璃仪器均需用稀盐酸浸泡，用自来水、蒸馏水冲刷。32.1 小型破坏机。

  33.1 试样制备称取250.0g试样经破坏并经过20目筛后，混匀后备用。

  0.1mol/L 磷酸，在振动器上振动提取30min，将提取液经过快速定性滤纸过滤；取20mL滤液置于250mL分液漏斗中，加50mL0.1mol/L碳酸氢钠溶液振摇2min，静置分层后，将三氯甲烷层放入另一个100mL分液漏斗中，如有少数乳化层，或即便三氯甲烷层悉数乳化均可放入分液漏斗中，参加50mL0.1mol/L碳酸氢钠溶液重复提取三氯甲烷层，静置分层后弃去三氯甲烷层，如三氯甲烷层仍乳化，弃去，不影响成果。碳酸氢钠水层并入榜首个分液漏斗中，加约5.5mL2mol/L盐酸溶液调理pH2~3，参加25mL三氯甲烷振摇2min，静置分层后，放三氯甲烷层于另一个盛有100mL水的250mL分液漏斗中，酸水层再用10mL三氯甲烷振摇、提取、静置，将三氯甲烷层并入同一分液漏斗中。振摇、静置分层，用脱脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲烷层于一个75mL蒸腾皿中，将蒸腾皿置蒸汽浴上通风挥干。用约8mL三氯甲烷分次将蒸腾皿中的残渣溶解，转入具尾管的10mL浓缩瓶中，置80℃水浴锅上用蒸汽加热吹氮气(N2)浓缩至干，参加0.2mL苯-乙腈(98+2)溶解残渣，摇匀，供薄层色谱点样用。

  称取试样20.0g(准确至0.01g)于200mL具塞锥形瓶中，参加30mL石油醚和100mL甲醇-水(55+45)，在瓶塞上抹上一层水盖严防漏。在振动器上振动提取30min后，经过快速定性滤纸滤入分液漏斗中，待基层甲醇水层辨明后，取出20mL滤液置于100mL分液漏斗中，调理pH5~6。参加25mL三氯甲烷振摇2min，静置分层后放出三氯甲烷层于另一分液漏斗中，再用10mL三氯甲烷重复振摇提取甲醇水层，如产生乳化现象，可滴加甲醇促使其分层，将三氯甲烷层合并于同一分液漏斗中，参加50mL~100mL 氯化钠溶液(参加量视种类不同而异，大豆加100mL，小麦、玉米则加50mL 左右)，振摇放置(如为大豆试样提取液还须悄悄重复倒转分液漏斗，使乳化层逐步上升。如乳化严峻可参加少量甲醇)，待三氯甲烷层弄清后，用脱脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲烷层于75mL蒸腾皿中(如为大豆试样须再参加10mL三氯甲烷振摇，三氯甲烷层合并于同一蒸腾皿中)，将蒸腾皿置蒸汽浴上通风挥干。以下操作自“用约8mL三氯甲烷分次将蒸腾皿中的残渣溶解”起，按甲法操作。

  薄层板经双向打开后，当阳性样品中赭曲霉毒素A 含量高时，赭曲霉毒素A 的荧光点会被横向拉长、使点变扁，或分红两个黄绿色荧光点。这是由于在横展过程中原点上赭曲霉毒素A 的量超越了硅胶的吸附才能，原点上的杂质和残留溶剂在横展中将赭曲霉毒素A 点横向拉长了，这时可依据赭曲霉毒素A 黄绿色荧光的总强度与规范荧光强度比较，估量需削减的滴加微升数或所需稀释倍数。经稀释后测定含量时可在样液点的左面基线上滴加二个规范点，赭曲霉毒素A 的量可为4ng、8ng。比较样液与两个规范赭曲霉毒素A 荧光点的荧光强度，概略定量。